在經(jīng)濟發(fā)展迅速的今天，報告不再是罕見的東西，報告中提到的所有信息應(yīng)該是準確無誤的。寫報告的時候需要注意什么呢？有哪些格式需要注意呢？下面我給大家整理了一些優(yōu)秀的報告范文，希望能夠幫助到大家，我們一起來看一看吧。

熒光定量pcr檢測報告怎么看篇一

熒光定量pcr 是一種新的實時定量檢測特定核酸技術(shù),它是核酸探針技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和pcr 技術(shù)的有機結(jié)合，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等特點,是對原有pcr 技術(shù)的革新,擴大了pcr 的應(yīng)用范圍。

實時熒光定量pcr（fq-pcr）作為熒光定量pcr技術(shù)的一種，是基于熒光能量傳遞技術(shù),通過受體發(fā)色團之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色基團轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色基團,受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號強度與dna產(chǎn)量成正比,檢測pcr 過程的熒光信號便可得知靶序列的初始濃度。它融匯pcr 技術(shù)的核酸高效擴增、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點,直接探測pcr 過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。目前已在眾多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

1、fq-pcr 在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

pcr 技術(shù)的應(yīng)用有許多局限,不能準確定量,假陽性率太高,只要有微量病原體存在就可以得到陽性結(jié)果,這不能完全作為診斷依據(jù),只有當一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義。fq-pcr實現(xiàn)了pcr 從定性到定量的飛躍,有效解決pcr 污染和對模板定量不準確等問題。

1.1在動物病原菌檢測和鑒定中的應(yīng)用

炭疽桿菌作為人獸共患病的病原,尤其炭疽桿菌的芽胞可作為生物武器的病原。科學(xué)家在100 l 純化空氣中加入炭疽桿菌芽孢,進行fq-pcr檢測,1 h 內(nèi)炭疽桿菌的單個芽孢就被檢測到。

1.2在動物病毒檢測和鑒定上的應(yīng)用

fq-pcr已應(yīng)用于許多病原體的檢測,如對艾滋病病毒、乙型肝炎病毒dna、尖銳濕疣皮損中hpvd-na、與鼻咽癌關(guān)系密切的eb 病毒、結(jié)核分支桿菌、巨細胞病毒、a 型和b 型流感病毒等病原體的檢測。

3.3在動物寄生蟲檢測和鑒定中的應(yīng)用

常用taqman 探針。如在被感染豬和鼠組織、全血、羊水以及腦脊髓液中的弓形蟲定量,其檢測極限相當于套式pcr , 但準確率大大提高。

2、fq-pcr在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

科學(xué)家采用taqman 探針檢測雞γ干擾素、采用rt-fq-pcr 證明中國黃牛背最長肌中cap nl mrna 表達量與宰后3 d 的牛肉嫩度高度相關(guān)等。

3、fq-pcr在其他方面的應(yīng)用

3.1在動物檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用

fq-pcr 可對動物源性飼料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量檢測。

3.2細胞因子表達定量檢測

常用fq-pcr 測定細胞因子mrna 表達情況,分析機體免疫狀態(tài)。利用fq-pcr 測定雞、豬在注射疫苗、免疫增強劑以及在感染某種疾病情況下體內(nèi)細胞因子的mrna 表達水平。

3.3環(huán)境監(jiān)測

應(yīng)用fq-pcr 對水資源及居家、辦公環(huán)境中的大腸埃希菌、藻青菌和一些寄生蟲進行監(jiān)測。

3.4轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用

用一個已知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為參照,同時對樣品作內(nèi)源基因和外源基因的fq-pcr。兩者達到熒光閾值時的ct 值可得到外源基因的拷貝數(shù);fq-pcr 還可用于轉(zhuǎn)基因動物的純合性鑒定及對轉(zhuǎn)基因后外源基因表達情況進行監(jiān)測。

熒光定量pcr檢測報告怎么看篇二

實時熒光定量pcr技術(shù)是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。其特點有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點定量的不準確性，并且消除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈dna，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。real-time o-pcr可以應(yīng)用于mrna表達的研究、dna拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。實時熒光定量pcr技術(shù)的基本原理

在pcr反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個pcr進程，在pcr循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入一個——ct值（threshold cycle）概念，ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，是在pcr循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當于基線熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的ct值。通常用不同濃度的標準樣品的ct值來產(chǎn)生標準曲線，然后計算相對方程式。

方程式的斜度可以用來檢查pcr的效率，所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)（r2＞0.99），這樣才能認為實驗的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量pcr儀都有軟件，可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量pcr技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mrna水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當?shù)难h(huán)閾值，擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實時定量pcr檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（snp）及突變分析：實時熒光定量pcr一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測：由于實時熒光定量pcr方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細胞病毒、eb病毒、流感病毒a、流感病毒b等病原體的檢測。熒光定量pcr問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

② 藥物療效考核：利用實時熒光定量pcr技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達。結(jié)果證明，實時熒光定量pcr系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量pcr方法都可以檢測出來。

目前用此方法進行過端粒酶htert基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤mdri基因、白血病wti基因、腫瘤er基因、前列腺癌psm基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量pcr技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實時熒光定量pcr方法對免疫組分進行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實時熒光定量pcr技術(shù)，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。檢測方法

eenⅰ法： 在pcr反應(yīng)體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產(chǎn)物的增加完全同步。sybr定量pcr擴增熒光曲線圖

pcr產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產(chǎn)物的單一性）探針法：

探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計合成定量pcr引物（或客戶提供文獻引物委托本公司合成）； /rna的抽提、定量、rna反轉(zhuǎn)錄；

預(yù)實驗，主要檢測引物的特異性和擴增效率； 6.正式定量實驗：對所有樣品上機檢測； 7.實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報告。收費標準

優(yōu)惠包干價：120元/樣/基因（sybrgreeni法，相對定量）

（含rna提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重復(fù)）；一個內(nèi)參免費（內(nèi)參3個重復(fù)）ct值（cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

pcr反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-15 值與起始模板的關(guān)系

每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。ct=-1/lg(1+ex)*lgx0+lgn/lg(1+ex)n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，x0為初始模板量，ex為擴增效率，n為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量pcr所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： 熒光探針：pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。而新型taqman-mgb探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（snp），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。

熒光染料：在pcr反應(yīng)體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料非特異性地摻入dna雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與pcr產(chǎn)物的增加完全同步。sybr僅與雙鏈dna進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定pcr反應(yīng)是否特異。3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。pcr產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定dna序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量pcr方法簡介

1）內(nèi)參照法：在不同的pcr反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在pcr產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化pcr產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）pcr－elisa法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的pcr－elisa法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。2．內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即pcr到達平臺期后進行檢測，而pcr經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔pcr儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標對定量pcr的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則pcr反應(yīng)變?yōu)殡p重pcr，雙重pcr反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。實時熒光定量pcr技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量pcr無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的： 1）ct值的重現(xiàn)性pcr循環(huán)在到達ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的ct值是恒定的。

2）ct值與起始模板的線性關(guān)系由于ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量pcr是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量pcr是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、cdc、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qpcr是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。

熒光定量pcr檢測報告怎么看篇三

熔解曲線耐藥結(jié)核檢測技術(shù)的原理及應(yīng)用 隨著抗結(jié)核藥物的廣泛使用，耐多藥結(jié)核病人不斷增加。耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，mdr-tb）是指至少同時對利福平（rifampin，rif）和異煙肼（isoniazid，inh）這兩種一線抗結(jié)核藥物耐藥。傳統(tǒng)的藥物敏感實驗（drug susceptibility test，dst）時間長，不利于耐多藥結(jié)核病患者的及時診治。因此，發(fā)展一種快速檢測耐多藥結(jié)核病的分子生物學(xué)檢測技術(shù)對于耐多藥結(jié)核病的早期診斷和治療十分重要。

一、熔解曲線耐藥結(jié)核檢測技術(shù)的發(fā)展

結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒于2013年1月獲頒國家食品藥品監(jiān)督管理局（sfda）醫(yī)療器械注冊證書，同時，“中國—比爾蓋茨基金會”已將該試劑盒納入該基金會2013年產(chǎn)品驗證目錄。2016年9月，sfda批準了另外三種試劑盒：“結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒”、“結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒”和“結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變檢測試劑盒”，分別用于檢測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物、鏈霉素藥物和乙胺丁醇藥物耐藥性，可用于臨床上結(jié)核病的輔助診斷。這些產(chǎn)品上市，有利于對耐多藥結(jié)核病患者及時診治，從而更好地控制與治療結(jié)核病。

二、熔解曲線耐藥結(jié)核檢測的工作原理

結(jié)核分枝桿菌異煙肼、利福平、氟喹諾酮、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥突變檢測試劑盒均采用熒光

pcr熔解曲線法進行檢測。熒光pcr熔解曲線法是一種簡單快速的pcr檢測技術(shù)，其主要檢測原理為耐藥基因的基因突變會導(dǎo)致dna雙鏈的結(jié)合力下降，從而導(dǎo)致相應(yīng)的dna熔解溫度（tm值）下降，即野生型基因有特定的tm值，而突變型基因因為結(jié)合能力下降導(dǎo)致tm值發(fā)生變化[1]，tm值下降的幅度與發(fā)生錯配的堿基數(shù)目、類型和位置有關(guān)，據(jù)此可以區(qū)分和檢測出突變型和野生型。

三、熔解曲線耐藥結(jié)核檢測產(chǎn)品結(jié)構(gòu)

tb酶混合液；② 對照結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒包含：① 擴增試劑：pcr mix a、pcr mix b及試劑：陽性對照，含四個野生型擴增靶基因的質(zhì)粒；③ tb陰性對照：不含靶基因的溶液。

四、熔解曲線耐藥結(jié)核檢測的突變位點[2]

抗結(jié)核檢測的突變位點 藥物 rfp rpob 507～534核心區(qū)位點 inh ahpc啟動子區(qū)（-44～-30以及-15～3位點）、inha94密碼子、inha啟動子區(qū)（-17～-8位點）以及katg315 密碼子

emb sm embb306、embb378-380、embb406及embb497四個常見突變位點

rpsl43、rpsl88密碼子，rrs513～517位點和rrs905～908位點

五、熔解曲線耐藥結(jié)核檢測的優(yōu)點① 熔解曲線檢測試劑盒是目前市場上檢測項目最齊全的試劑盒，可實現(xiàn)mdr和xdr一步檢測

② 實驗全程采用閉管法操作，無pcr后處理，降低了擴增產(chǎn)物交叉污染的發(fā)生率[3]

③ 檢測時間較短（在3小時內(nèi)完成），可實現(xiàn)自動判讀④ 可在現(xiàn)有的實時熒光定量pcr分析儀上操作，不需要昂貴的專用設(shè)備熔解曲線法與現(xiàn)有其他檢測方法相比，檢測項目更為齊全，并且可在3h左右獲得藥敏結(jié)果，適用于耐多藥結(jié)核病的快速篩查，有利于更快的對耐多藥患者進行診斷治療并減少耐多藥患者的傳播。這種檢測方法對于我國結(jié)核病患者和結(jié)核病策略的影響還需要進行大范圍的、進一步的調(diào)查研究。

參考文獻： [1] 蔡挺，李巧云，張順，等?；蛐酒夹g(shù)檢測常見革蘭陰性桿菌 耐藥基因的研究[j]。中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（21）：4411-4414

[2] 嚴虹，施旭東，胡春梅，等。探針熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素耐藥突變。臨床檢驗雜志，2015，33（10）：729-733

[3] qiu yh，zan zl，yi ql，et al．multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled，self-quenched probes [j].plos one, 2011, 6(4): e19206

熒光定量pcr檢測報告怎么看篇四

乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒

樣本要求

1.適用標本類型：血清或血漿 2.標本采集

1）血清：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫放置30—60min，血標本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500 rpm離心5分鐘，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管

2）血漿：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含edta-2k或枸櫞酸鈉的玻璃管，立即顛倒玻璃管混合5—10次，使抗凝劑和靜脈血充分混勻，5—10分鐘后即可分離血漿，轉(zhuǎn)移至1.5 ml滅菌離心管

3.標本保存與運送：所采集的標本可立即用于測試，也可以保存在—20℃待測，保存期為6個月，標本運送采用0℃冰壺。檢驗方法

提取（樣品制備區(qū)）

將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、hbv 強陽性質(zhì)控品、hbv臨界陽性質(zhì)控品進行同步處理。1）取200μl樣品，加入450μldna提取液i和4μl的內(nèi)標溶液，用振蕩器劇烈混勻15秒，瞬時離心數(shù)秒。100℃恒溫處理10±1分鐘 2）12000rpm離心5分鐘，備用 試劑準備（試劑準備區(qū)）直接使用hbv-pcr反應(yīng)管 3.加樣（樣品制備區(qū)）

往上述hbv反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入待測樣本、陰性質(zhì)控品、hbv 強陽性質(zhì)控品、hbv臨界陽性質(zhì)控品和陽性定量參考品的上清液各20μl。蓋緊管蓋，8000rpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴增檢測區(qū)。

擴增（擴增和產(chǎn)物分析區(qū)）5.結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后的圖像調(diào)節(jié)baseline值得start值、end值以及threshold值，點擊analysis自動獲取分析結(jié)果，在repoet界面查看結(jié)果，記錄未知樣本數(shù)值（c）6.質(zhì)量控制

(1)陰性質(zhì)控品：fam通道無對數(shù)增長期或ct值等于30，vic檢測通道擴增曲線為明顯對數(shù)增長期

(2)hbv陽性質(zhì)控品：fam通道有明顯的對數(shù)增長期且ct值小于30(3)hbv陽性定量參考品：fam通道有明顯的對數(shù)增長期，呈典型s形曲線。ct<29且r2>0.98 7.結(jié)果判斷（1）如果在fam通道無明顯的對數(shù)增長期或ct值等于30，在vic檢測通道擴增曲線有對數(shù)增長期，則判定樣本的hbv dna濃度小于檢測靈敏度。（2）如果在fam通道有對數(shù)增長期或ct值小于30 則1）若樣本的c<100，則樣本的hbv dna濃度<100iu/ml 2）若樣本的100《c《5.00e+008，則樣本的hbv dna濃度= c iu/ml 3）若樣本的c>5.00e+008，則樣本的hbv dna濃度>5×10 ? iu/ml

熒光定量pcr檢測報告怎么看篇五

實時熒光定量pcr檢測限的統(tǒng)計推斷

來源：中國論文下載中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭長華，常武

【摘要】 檢測限是檢測方法的重要性能指標，用poisson分布的概率函數(shù)分式計算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體出現(xiàn)該結(jié)果的概率。以實時熒光定量pcr(fqpcr)檢測乙型肝炎病毒dna結(jié)果為例，計算可知，一次抽樣反應(yīng)管的檢測結(jié)果≥4時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(p<0.05)。因而檢測血清中病原體時擴增反應(yīng)管中的檢測限是4拷貝/ul計算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結(jié)果為0的概率可達0.368，結(jié)果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0。結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/l表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/l～1 003 000拷貝/l的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至l。

【關(guān)鍵詞】 實時熒光定量pcr；檢測限；統(tǒng)計推斷

statistical conclusion of limit of quqntitation in realtime fluorescence quantitative pcr

abstract:limit of quantiation is a important performance index of assay s of sample drawing are calculated through possiblity function equation of poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is example,in realtime fluorescence quantitaive pcr to assay hbv dna,only when sample drawing results≥4,significance of difference(p<0.05)could be deduced between population and limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is ility of 100 000 copies/l denoting results between 997 000 copies/l to 1 003 000 copies/l in one sample drawing is drawing unit ul could not be replace by ml or words：realtime fluorescence quantitative pcr；limit of quantitation;statistical conclusion

檢測限是檢測方法的重要性能指標，只有在檢測報告中明確表達了檢測方法的檢測限，該檢測報告在各實驗間及同一項目的各種檢測方法間才可進行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統(tǒng)的檢測限。當前，檢測限術(shù)語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每個詞語的實際含義中包含有各自的實驗方式、數(shù)據(jù)處理方式及由數(shù)據(jù)作出的推論等。我們采用統(tǒng)計學(xué)方法，以期得到一致的實時熒光定量pcr(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,fqpcr)檢測限，現(xiàn)介紹如下。

文獻中fqpcr檢測限的描述

檢測乙型肝炎病毒dna的文獻中檢測限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術(shù)語，它等于已知的高拷貝hbv dna血清10倍系列稀釋后能檢測到擴增曲線的最大稀釋倍數(shù)管濃度。表述有：陰性hbv dna≤106拷貝/升［4］；熒光定量pcr法檢測靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、8.6×102拷貝/ml［7］；hcⅱ法檢測靈敏度1.4×105拷貝/ml［7］；103 eq/ml理論值時到達檢測極限［3］；pcrfp檢測hbv dna的最低檢測出量1×101拷貝［2］；bdna在105 eq/ml時到達檢測極限［3］。以上檢測限術(shù)語各不相同，且同一方法檢測hbv dna在上述各實驗室發(fā)出同樣的“hbv dna低于檢測下限”的報告時其實際hbv dna拷貝數(shù)相差可達100倍。

fqpcr檢測過程簡介

以測定血清乙型肝炎病毒dna為例：將40 μl血清樣本加40 μl dna提取液處理后，將其中2 μl（相當于1 μl血清）加入主反應(yīng)液（含dna引物、酶、dna構(gòu)件分子dntp等）管中，在自動熱循環(huán)上進行溫度循環(huán)，自動熱循環(huán)儀記錄每一反應(yīng)管在每一次溫度循環(huán)的熒光強度，記30次溫度循環(huán)后結(jié)束。在pcr循環(huán)過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為ct值（cyclethreshold),它與反應(yīng)管中dna起始拷貝數(shù)的對數(shù)值（lgn)呈非常顯著的直線相關(guān)關(guān)系。自動熱循環(huán)儀對標準樣品自動生成一條ct值對于起始拷貝數(shù)值（lgn)的工作曲線，并通過該工作曲線來確定待測未知樣品反應(yīng)管的起始拷貝數(shù)（n）。當30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號時，儀器默認ct值為30，不計算起始拷貝。確定fqpcr檢測限的統(tǒng)計學(xué)原理

如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應(yīng)量的波動服從正態(tài)分布規(guī)律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定。可信限為95%時檢測限＝x空白+2.s空白；可信限為99.7%時檢測限=x空白+3.s空白。這是目前多數(shù)檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應(yīng)是一致的［1］，fqpcr檢測限也應(yīng)是推論總體與空白有統(tǒng)計學(xué)差異的最小抽樣結(jié)果。

fqpcr檢測限的統(tǒng)計推斷

假設(shè)病原體在血液等體液中的分布是隨機的，則單位體積中(如1.0 μl)病原顆粒數(shù)的分布服從poisson分布。以poisson分布的概率函數(shù)公式計算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體概率。從理論上來說，使用pcr測定技術(shù)測定病原體核酸序列的量可低至1個拷貝［2］。例如：血清標本中加入等量的dna提取液，于離心管中煮沸，4 ℃放置，離心，吸取上清液2 μl作模板 進行擴增檢測(2 μl上清液相當于抽樣1 μl血清)［2］，其中至少有1個拷貝的hbv dna才能有典型擴增反應(yīng)，這時檢測結(jié)果是1拷貝/μl。由poisson分布的概率函數(shù)公式可計算出1次抽樣檢測結(jié)果出現(xiàn)0時，推斷總體為1～9的概率見表1。

表1 總體為1～9時抽樣為0的概率及總體（略）

在fqpcr檢測hbv dna中，當30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號(即當ct≥30)，反應(yīng)管檢測結(jié)果為0時，推論總體拷貝數(shù)為1～9的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時報告0拷貝的可信限度低于50%)?？傮w為1時一次抽樣結(jié)果分別為1～9時的概率見表1。當一次抽樣結(jié)果≥4時，推論總體為1的概率≤0.015 33，所以對于病原體的檢測，一次抽樣反應(yīng)管檢測結(jié)果≥4拷貝時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(p<0.05)。因而上述檢測血清中病原體時一次抽樣反應(yīng)管的檢測限是4拷貝/μl。當總體為1、2、3時一次抽樣結(jié)果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質(zhì)量評價樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時，無論實驗室實際檢測質(zhì)量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實驗室檢測結(jié)果為0而被判為不符合［按靶值的對數(shù)值gm±0.5 log(10)［9］作為可接受的定量范圍］。2005年衛(wèi)生部室間質(zhì)量評價中靶值為1.51拷貝數(shù)/μl的樣本符合率僅35.2%；mancini c 等［9］報道一些實驗室對檢測下限附近的樣本(3.00 log iu/ml)準確定量有困難；raggi cc等［10］也報道28.6%的實驗室(12/42)對最低濃度的樣本不能定量。這些都是因為檢測下限附近的樣本一次抽樣結(jié)果為0的概率太大所致，對此我們將另文詳細討論。造成上述文獻中檢測限差異較大的可能原因如下：用于10倍系列稀釋的已知高拷貝hbv dna血清本身拷貝數(shù)的差異；對檢測限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測到典型擴增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述hbv dna檢測中，抽樣單位是1 μl血清［如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 μl上清液相當于實際含12.5 μl血清，則抽樣單位也只是12.5 μl］，而報告結(jié)果的單位是ml甚至l。當總體為1拷貝/μl時表示一次抽樣結(jié)果為0的概率達0.368，結(jié)果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0，結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997(poisson分布總體>50時近似正態(tài)分布，范圍是x±uα*√x，可信限為99.7%時uα=3);總體為100 000拷貝/l時表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/l～1 003 000拷貝/l的概率為0.997。文中推理以hbvdna的fqpcr檢測為例，其他病源體核酸的fqpcr檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應(yīng)管的檢測限4拷貝/反應(yīng)管；如反應(yīng)管中加入模板量相當于12.5 μl血清則檢測限相當于0.32拷貝/ μl。此推斷僅是針對fqpcr技術(shù)本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數(shù)進行討論?！緟⒖嘉墨I】

［1］ 馮仁豐.分析靈敏度(檢測限)［j］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2002，17(3)：133134.［2］ 郭晏海，張菊，趙錦榮，等.聚合酶鏈反應(yīng)熒光偏振技術(shù)在乙型肝炎病毒dna檢測中的應(yīng)用及價值［j］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(1)：2627.［3］ 張東華，金根娣，陸志檬.二種分子雜交技術(shù)定量檢測臨床標本中hbv dna的比較［j］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2003，18(3)：163164.［4］ 何敏，楊朝霞，劉微， dna定量檢測方法的評價［j］.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2005，26(2)：123124.［5］ 劉停，韓亞萍，張永祥.熒光定量pcr檢測慢性乙型肝炎患者血清hbvdna及其意義［n］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，23(1)：7879.［6］ 黃希田，顏鳴鶴，凌喬，等.定量pcr微流芯片法定量檢測血清hbv dna含量.中國感染控制雜志，2003，2(2)：8991.［7］ 王豪，陶其敏，吳娟，等.兩種乙型肝炎病毒dna定量檢測方法的比較與評價［j］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2002，25(5)：318320.［8］ 李金明，鄧巍，王露楠，測定乙型肝炎病毒dna弱陽性質(zhì)控血清的適用性研究［j］.臨床檢驗雜志，2000，18(1)：67.［9］ mancini c,pisani g,azzi a,et labortory comparison of qualitative detection of hepatitis c(hcv)virus rna in diagnostic virology:a multicente study(ms)in italy［j］.j clin virol，2004，30(4):313319.［10］ raggi cc,verderio p,pazzagli m,et italian program of external control for quantitative assays based on realtime pcr with taqman probes［j］.clin chem lab med，2005，43(5)：542548.